Cách pha môi trường agar

Tip: Chuẩn Bị Môi Trường Nuôi Cấy Để Tiết Kiệm Thời Gian Và Tránh Lãng Phí

Môi trường nuôi cấy là một phần không thể thiếu của gần như mọi phương pháp nhận diện và đếm vi sinh vật được thực hiện trong phòng thí nghiệm vi sinh. Đảm bảo rằng môi trường nuôi cấy phù hợp để sử dụng là rất quan trọng để đảm bảo kết quả chính xác và dễ hiểu. Môi trường nuôi cấy không đạt tiêu chuẩn có thể dẫn đến một hoặc nhiều hệ quả sau:

• Giảm tốc độ tăng trưởng/ phục hồi
• Ức chế vi sinh vật chủ đích
• Không ức chế được vi sinh vật cạnh tranh
• Giảm thời hạn sử dụng môi trường

Những kết quả này có thể ảnh hưởng đến tính chính xác của báo cáo về kết quả hoặc chất lượng, độ an toàn của các sản phẩm thực phẩm và các mẫu liên quan. Do đó, các hành động khắc phục có thể tránh được như thông báo và thu hồi kết quả có thể khiến uy tín và tài chính của tổ chức gặp rủi ro. Trong trường hợp xấu nhất, người sử dụng có thể bị ảnh hưởng đến sức khỏe và thậm chí cả tính mạng có thể bị đe dọa.

Ở đây, chúng tôi trả lời các câu hỏi phổ biến nhất trong năm lĩnh vực chính để cung cấp cho bạn cơ hội tốt nhất để chuẩn bị môi trường phù hợp để sử dụng lần đầu tiên hay mọi lúc.

1. Những điều kiện bảo quản tốt nhất cho môi trường đông khô và hóa chất bổ sung là gì?

Luôn đảm bảo các sản phẩm được sử dụng trong việc chuẩn bị môi trường nuôi cấy nằm trong thời hạn sử dụng và được lưu trữ theo các điều kiện quy định của nhà sản xuất. Các nhà cung cấp môi trường nuôi cấy xác định tổng thời hạn sử dụng trên các hộp chưa mở được lưu trữ trong các điều kiện chính xác. Sau khi mở, các sản phẩm có thể xuống cấp nếu không được xử lý và lưu trữ chính xác. Ví dụ, hầu hết các môi trường nuôi cấy đông khô có nghĩa là chúng dễ dàng hấp thụ độ ẩm. Điều này sẽ ảnh hưởng đến các đặc tính vật lý như màu sắc và pH và có thể ảnh hưởng đến hiệu suất vi sinh của môi trường.

Kẻ thù chính của môi trường nuôi cấy đông khô là độ ẩm, nhiệt độ và ánh sáng. Luôn luôn kiểm tra bao bì để đảm bảo tuân thủ các điều kiện bảo quản chính xác, và thông thường môi trường nuôi cấy đông khô thường được lưu trữ ở các điều kiện sau:

• Bảo quản ở nhiệt độ phòng, tức là 10-30°C và tránh dao động nhiệt độ hơn một vài độ [hầu hết các sản phẩm có bổ sung hóa chất đều yêu cầu bảo quản ở 2-8°C].
• Bảo vệ khỏi ánh sáng mặt trời trực tiếp [bao bì gốc sẽ bảo vệ sản phẩm nhưng tránh lưu trữ trên bệ cửa sổ hoặc các khu vực tương tự].
• Đảm bảo các sản phẩm đã mở được đóng nắp chặt chẽ.
• Tránh lưu trữ trong điều kiện nóng, ẩm như phòng hấp, hoặc khu vực rửa.

2. Làm thế nào để tôi sử dụng môi trường đông khô một cách tốt nhất?

Thực hiện theo các hướng dẫn của nhà cung cấp và tham khảo bất kỳ dữ liệu an toàn nào trước khi chuẩn bị môi trường nuôi cấy.

• Đảm bảo rằng các vật chứa, vật để cân và các dụng cụ khác đều sạch sẽ.
• Nên sử dụng nước tinh khiết để pha môi trường, tức là nướcđã được chưng cất, khử ion, được sản xuất bằng thẩm thấu ngược hoặc có chất lượng tương đương. Không nên sử dụng nước máy vì nó chứa tạp chất có thể ảnh hưởng đến các đặc tính của môi trường. Khuyến khích sử dụng loại nước có độ dẫn điện phải dưới 15 micro Siemens [µScm-1] và tốt nhất là dưới 5 µScm-1 [tương đương với điện trở suất 0,2 MΩ]. Nên trữ nước trong các thùng chứa làm từ vật liệu trơ. Lưu trữ trong các thùng chứa polythene có thể dẫn đến pH có tính axit, trong khi lưu trữ trong thủy tinh và soda có thể gây ra pH kiềm.
• Chuẩn bị môi trường nuôi cấy trong bình khoảng gấp đôi thể tích cuối cùng để cho phép việc xáo trộn dễ dàng.
• Các hộp môi trường mở nên để tránh xa nơi có gió và độ ẩm. Sử dụng tủ an toàn để kiểm soát bột, hoặc thiết bị bảo vệ cá nhân. Nên sử dụng số dư có khả năng đạt được dung sai trong vòng 1%.
• Cần đo thể tích nước cần thiết và đổ một nửa vào bình chuẩn bị, sau đó mới cân môi trường. Lắc mạnh để trộn và sau đó thêm phần nước còn lại xuống hai bên để đẩy bất kỳ môi trường còn dính thành xuống dung dịch.
• Môi trường chứa agar nên được đun nóng để hòa tan agar trước khi hấp khử trùng.
• Môi trường nên được hấp khử trùng ngay khi chuẩn bị. Nắp của các chai có nắp vặn phải được thắt chặt trước khi đặt chai vào nồi hấp để thoát khí nóng.
• Trừ khi được chỉ định, không nên điều chỉnh pH của môi trường trước khi khử trùng. Nó nên được đo khử trùng sau và phù hợp với phạm vi pH được chỉ định.

3. Kỹ thuật khử trùng thích hợp cho môi trường của tôi là gì?

Môi trường đông khô và nước được sử dụng để chuẩn bị môi trường không vô trùng và thường sẽ chứa một số vi sinh vật. Nếu môi trường nuôi cấy không được khử trùng trước khi sử dụng, các vi sinh vật này sẽ trộn lẫn mẫu thử và có thể dẫn đến kết quả dương tính giả. Ngoài ra, thành phần agar của môi trường phải được làm nóng đến khoảng 100°C để hòa tan trong nước. Có thể sử dụng một số phương pháp khử trùng môi trường nuôi cấy khác nhau, với môi trường nhạy cảm hơn đòi hỏi điều kiện khử trùng ít khắc nghiệt hơn. Khử trùng là một phần của quy trình chuẩn bị nuôi cấy có khả năng gây ra thiệt hại nhiều nhất, vì vậy cần đặc biệt cẩn thận để đảm bảo thực hiện đúng.

Môi trường nuôi cấy có thể bị hư hỏng bởi quá trình xử lí nhiệt. Một số môi trường nuôi cấy hỗn hợp có chứa peptide, đường, khoáng chất và kim loại dẫn đến phá hủy chất dinh dưỡng, bằng cách phân hủy nhiệt trực tiếp hoặc do phản ứng giữa các thành phần trong môi trường. Các sản phẩm độc hại gây ra bởi quá trình oxy hóa hóa học cũng có thể được hình thành trong quá trình xử lý nhiệt. Mặt khác, xử lí nhiệt cũng có thể làm giảm tính chọn lọc của môi trường. Do đó, điều quan trọng là phải tối ưu hóa quy trình sao cho môi trường được vô trùng sau khi gia nhiệt nhưng gây ra thiệt hại tối thiểu cho môi trường.

Mặc dù hạn chế sai sót, sự giảm năng suất có thể xảy ra khi khử trùng các chai môi trường chứa có nhiều hơn một lít môi trường. Điều này làm cho thời gian gia nhiệt và làm mát lâu hơn, nhưng cũng có thể bị ảnh hưởng do thiết kế nồi hấp. Đây là trường hợp đặc biệt khi giai đoạn làm mát của quy trình không được quạt hỗ trợ, nước làm mát được tưới lên vỏ ngoài hoặc phương pháp làm mát phun.

Thông thường các môi trường ở phía trong một lần hấp quá đầy dễ hư hỏng nhất. Cả thời gian thâm nhập và làm mát đều có thể được tối ưu hóa bằng cách đảm bảo nồi hấp không bị quá tải và các chỗ chứa được sắp đặt trong buồng để cung cấp một không gian đồng nhất giữa chúng và thành buồng.

Mẹo sử dụng Nồi hấp:

• Hấp đúng nhiệt độ của môi trường được cung cấp bởi nhà sản xuất.
• Nồi hấp cần được hiệu chuẩn. Quá trình khử trùng phải được xác nhận bằng cách sử dụng nhiệt kế thay vì bộ ghi dữ liệu.
• Một quá trình lí tưởng sẽ gia nhiệt nhanh và đồng đều.
• Không nên xử lí chung các loại môi trường có cách khử trùng khác nhau.
• Không nên đặt quá nhiều vào một nồi hấp.
• Tránh cài đặt thời gian hấp quá lâu và nhiệt độ quá cao.
• Tuân thủ theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
• So sánh quá trình của các nồi hấp khác.
• Tất cả nồi hấp nên được kiểm tra tại các khoảng thời gian cố định để đảm bảo rằng chúng hoạt động chính xác. Việc bảo trì và kiểm tra nồi hấp phải được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

Với các loại môi trường sử dụng thường xuyên, thể tích lớn [ví dụ: môi trường tăng sinh buffer pepton water],Mỹ Âncung cấp sản phẩm môi trường túi đông khôDry-bag, fit-bagtừ tập đoànThermoFisher Scientific. Là loại môi trường đông khô dạng túi, khi sử dụng chỉ cần sử dụng màng lọc tiệt trùng để bơm nước cất vào và bỏ qua bước hấp khử trùng. Thời gian chuẩn bị nhanh, không cần các dụng cụ chiết rót, tiết kiệm không gian làm việc.

Chuẩn bị môi trường

Hầu hết luôn có khó khăn khi phải xử lí một lượng lớn môi trường. Một giải pháp cho vấn đề này là sử dụng các chai môi trường có thể tích lớn hơn [lớn hơn một lít]. Để khắc phục vấn đề gia nhiệt kém cho môi trường agar thì dùng cách khuấy liên tục hoặc khuấy trộn môi trường trong giai đoạn gia nhiệt. Các vật chứa có kích thước khác nhau sẽ đạt thời gian, nhiệt độ hấp nhanh hơn, vì thế hiệu quả cao hơn và giảm thiệt hại do nhiệt.

Các vật sử dụng để cân cần làm sạch trước khi sử dụng. Phải cẩn thận để tránh làm lẫn các môi trường khác với nhau. Kiểm tra thời gian và thể tích sử dụng. Môi trường phải được bảo quản đúng điều kiện của nhà sản xuất

Lò vi sóng

Lò vi sóng không được khuyến cáo để khử trùng hoặc đun môi trường nuôi cấy. Những lý do cho điều này là:

Gia nhiệt không đồng đều.

Quá nhiệt ở tụ điểm và làm chai môi trường bị nổ.

Khử trùng bằng lò vi sóng chỉ hiệu quả khi có độ ẩm. Các phần bên trong phía trên sẽ gây nhiễm nếu không được xử lí trước đó.

4. Làm thế nào để tôi chuẩn bị tốt môi trường tiệt trùng?

Môi trường chất lỏng nên chỉ sử dụng một chai trước và sau khi hấp. Nắp đậy phải mở lỏng trước khi hấp và đóng chặt sau hấp, để mát ở nhiệt độ phòng. Môi trường thạch cần để mát ở ngoài vài phút rồi mới đưa vào bể ổn nhiệt khoảng 50oC để tránh sốc nhiệt. Nếu môi trường được sử dụng trong phương pháp đổ đĩa, môi trường được thêm vào mẫu thử nên phải được ủ ở nhiệt độ 44 ° C đến 47 ° C hoặc theo quy định trong phương pháp tiêu chuẩn có liên quan. Môi trường cần được sử dụng ngay khi đã đủ nhiệt độ hoặc giữ tối đa bốn giờ trong bể ổn nhiệt. Điều này còn phụ thuộc vào từng loại môi trường mà thời gian có thể ngắn hơn.

Hóa chất bổ sung cho môi trường

Các chất bổ sung không bền nhiệt nên được thêm vào môi trường sau khi làm mát đến 50 ° C hoặc theo chỉ dẫn. Chất bổ sung vô trùng nên ở nhiệt độ phòng trước khi thêm vào môi trường thạch vì chất lỏng lạnh có thể làm cho agar thành gel hoặc tạo thành vảy trong suốt. Tất cả các chất bổ sung nên được trộn vào môi trường một cách nhẹ nhàng và kỹ lưỡng, và phân phối vào các môi trường càng nhanh càng tốt.

Máu được sử dụng để điều chế agar máu nên càng tươi càng tốt và nên được lưu trữ ở 2°C đến 8°C [toàn bộ máu không được đông lạnh]. Máu nên ở nhiệt độ phòng trước khi thêm vào môi trường hoặc có thể được làm ấm trong tủ ấm ở 30 ° C đến 37 ° C. Không để trong lồng ấp lâu hơn cần thiết. Trộn trong môi trường là điều cần thiết để đảm bảo hòa tan.

Kháng sinh và hỗn hợp kháng sinh thường được sử dụng để tạo môi trường chọn lọc. Chúng thường được bảo quản dưới dạng đông khô để bổ sung vào môi trường cơ bản. Chúng phải được lưu trữ theo hướng dẫn, thường ở 2 ° C đến 8 ° C. Tuy nhiên một số chất có thể cần phải lưu trữ đông lạnh. Các hướng dẫn trên bao bì phải được tuân theo để đảm bảo rằng sản phẩm được lưu trữ chính xác.

Chuẩn bị đĩa thạch

Hạn chế gây nhiễm trong quá trình thực hiện.

Sau khi làm lạnh đến 50°C, hoặc theo yêu cầu với việc bổ sung các chất bổ sung vô trùng, môi trường nên được trộn nhẹ nhàng và kỹ lưỡng, không tạo thành bong bóng và phân phối vô trùng vào các đĩa Petri vô trùng.

Các đĩa Petri phải ở trên một bề mặt bằng phẳng và không có bọt phía trên.

Môi trường đổ vừa đủ vào các đĩa Petri, ví dụ cho một đĩa 90 mm 18 ml đến 20 ml nên là một thể tích phù hợp. Nếu các đĩa được lưu trữ, tiếp xúc với môi trường mà không có nắp đậy, trải qua quá trình ủ hoặc ủ cao hơn 37 ° C thì có thể cần một thể tích lớn hơn.

Nếu cần, làm khô đĩa bằng cách mở nắp và agar hướng xuống dưới ở 25 ° C đến 50°C hoặc trong tủ cấy trong 15 đến 30

phút ở 37 ° C. Các đĩa không nên quá khô và phải giữ lại lượng ẩm nhất định

Nếu muốn lưu trữ các đĩa, chúng nên được làm mát trước khi đặt vào tủ lạnh để tránh ngưng tụ quá mức. Các đĩa không nên phơi quá khô trước khi lưu trữ.

5. Làm thế nào để quản lí môi trường sau khi xử lí?

Thời hạn sử dụng tối ưu cho các đĩa và chai môi trường phải được xác định bằng việc thử nghiệm vi sinh tại thời điểm chuẩn bị và trong thời gian bảo quản của riêng mỗi phòng thí nghiệm. Điều đó giúp thiết lập thời hạn sử dụng của tất cả các môi trường được chuẩn bị dựa trên thử nghiệm hiệu suất và ngày kiểm tra cho các chai môi trường. Chỉ nên ủ số lượng đĩa thích hợp để kiểm tra vô trùng, không phải toàn bộ lô. Các đĩa được sử dụng để kiểm tra vô trùng nên được loại bỏ. Mất độ ẩm từ thạch là nguyên nhân phổ biến gây ra hiệu suất vi sinh kém. Cho nên các đĩa thạch còn ẩm chỉ nên được làm khô trước khi sử dụng.

Đĩa thạch

Chất lượng của các đĩa môi trường có giảm hiệu quả sau khi chuẩn bị. Tốc độ suy giảm sẽ thay đổi tùy theo sự ổn định của thành phần môi trường. Chúng cũng sẽ bị ảnh hưởng bởi phương pháp chuẩn bị, lưu trữ và thay đổi nhiệt độ

Môi trường đã chuẩn bị phải được kiểm tra trước khi sử dụng như sự nhiễm, làm đầy không đều, bong bóng trên bề mặt thạch, thay đổi màu sắc, tan máu và các dấu hiệu đóng cục hoặc mất nước như co lại, nứt và giảm thể tích. Bất kỳ đĩa hoặc chai bị lỗi nên được loại bỏ

Tóm lại:

Bảo quản ở 2°C đến 8°C hoặc lưu những chỗ mát. Tránh xa khu vực có lưu lượng không khí cao, sẽ làm cho môi trường bị khô. Nếu lưu trữ phương tiện trong tủ lạnh, không lưu trữ đĩa bên cạnh ngăn cấp đông hoặc nơi có khả năng gây đóng băng.

Nên úp đĩa khi lưu trữ để ngăn hơi ẩm len vào bề mặt thạch.

Bọc đĩa trong một màng lưu trữ thích hợp hoặc đặt trong các hộp kín để tránh mất độ ẩm.

Các đĩa phải được lưu trữ trong bóng tối hoặc dưới ánh sáng nhân tạo có bước sóng phù hợp để ngăn chặn quá trình quang hóa.

Thời hạn sử dụng tốt nhất cho các đĩa môi trường:

• Lưu đĩa thạch dưới bốn tuần.
• Lưu đĩa thạch máu dưới bảy ngày.
• Các đĩa môi trường có tính chọn lọc lưu trong vòng bảy ngày

Môi trường lỏng

Môi trường lỏng, chất pha loãng và agar đóng chai không chọn lọc, sử dụng lại hoặc khử trùng, có thể được bảo quản ở nhiệt độ mát hoặc nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng trong vòng sáu tháng. Môi trường chọn lọc đã chuẩn bị không nên được lưu trữ trong hơn ba tuần ở 2°C đến 8°C. Một số môi trường lỏng chọn lọc có thể lưu đến ba tháng khi được lưu trữ trong bóng tối.

Liên hệ với đội hỗ trợ kỹ thuật của chúng tôi để tìm hiểu thêm về chuẩn bị môi trường nuôi cấy hiệu quả: