Chọn mô như thế nào để nuôi cấy bằng phương pháp nuôi cấy mô De thành công

Skip to content

Ở phần I, nói tổng quan về nuôi cấy mô thực vật là gì, tiếp theo phần II nói về các thành phần trong môi trường nuôi cấy. Trong phần III, sẽ giới thiệu các kỹ thuật nuôi cấy mô thường được dùng.

Nội dung bài viết sẽ được trình bày như sau:

1. Nuôi cấy mô thực vật và lợi ích từ nuôi cấy invitro phần I
2. Nuôi cấy mô thực vật và thành phần môi trường nuôi cấy invitro phần II
3. Nuôi cấy mô thực vật và các chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy phần II-a
4. Nuôi cấy mô thực vật và môi trường bổ sung các loại hormone phần II-b
5. Nuôi cấy mô thực vật và các loại kháng sinh trong môi trường nuôi cấy phần II-c
6. Nuôi cấy mô thực vật và các kỹ thuật nuôi cấy mô phần III

Mẫu mô thực vật được lấy từ phần đỉnh của cây và đưa vào điều kiện nuôi cấy in-vitro SƠ LƯỢC CÁC KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT NUÔI CẤY PHÔI

Sự ghi nhận đầu tiên về nuôi cấy phôi là công trình của Charles Bonnet ở thế kỷ XVIII. Ông tách phôi Phascolus và Fagopyrum trong trong đất và nhận được cây nhưng là cây lùn. Từ đầu thế kỷ XX các công trình nuôi cấy phôi dần được hoàn thiện hơn. Từ các công trình nghiên cứu trước đó, Knudson [1922] đã nuôi cấy thành công phôi cây lan trong môi trường chứa đường và khám phá ra một điều là nếu thiếu đường thì phôi không thể phát triển thành protocom. Raghavan [ 1976, 7980] đã công bố rằng phôi phát triển qua hai giai đoạn dị dưỡng và tự dưỡng. Ở giai đoạn dị dưỡng [ tiền phôi] cần có các chất điều hoà sinh trưởng để phát triển. Trong giai đoạn tự dưỡng sự phát triển của phôi không cần chất điều hoà sinh trưởng. Đối với nuôi cấy phôi, như đã biết đường đóng vai trò rất quan trọng. Trong nhiều trường hợp thì đường sucrose cho kết qủa tốt hơn các đường khác. Ngoài ra một số chất tự nhiên như nước dừa, nước chiết malt, casein thuỷ phân, là những chất rất cần trong nuôi cấy phôi. Các chất kích thích sinh trưởng như GA3, auxin, cytokinine thường được dùng nhiều trong nuôi cấy phôi. Auxin thường dùng ở nồng độ thấp. Kinetin có vai trò đặc biệt cho sự phát triển của phôi.

Các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của phôi nuôi cấy in vitro. Thường phôi nuôi cấy cần nhiệt độ và ánh sáng thấp hơn phôi phát triển tự nhiên.

NUÔI CẤY MÔ VÀ CƠ QUAN TÁCH RỜI

Wetmore [1946] nuôi cấy đỉnh chồi cây nho dại, cùng với một số tác giả khác, ông đã chứng minh các bộ phận của cây đều có thể nuôi cấy khi gặp điều kiện thuận lợi. Lon và Ball [1946] với thí nghiệm nuôi cấy đỉnh chồi cây măng tây đã cho thấy khi nuôi các bộ phận của cây như lá, thân, hoa thì khả năng tạo mô sẹo nhiều hơn. Nhu cầu dinh dưỡng khi nuôi cấy các bộ phận khác nhau của cây là khác nhau nhưng có thể thấy một số yêu cầu chung như nguồn cacbon dưới dạng đường và các muối của các nguyên tố đa lượng [ nito, phospho, kali, calxi] và vi lượng [ Mg, Fe, Mn, Co,Zn,…]. Ngoài ra cần một số chất đặc biệt như vitamin [B1, B6, B3, …] và các chất điều hoà sinh trưởng. Muốn duy trì sinh trưởng và phát triển của cơ quan nuôi cấy cần thường xuyên cấy chuyền qua môi trường mới.

Đối với nuôi cấy mô, ngoài những thành phần dinh dưỡng như đối với nuôi cấy cơ quan tách rời, cần bổ sung thêm các chất hữu cơ chứa ít nitơ dưới dạng acide amine, đường và inositol. Trong trường hợp nuôi cấy mô, các chất điều hoà sinh trưởng có vai trò quan trọng hơn vì các mô tách rời không có khử năng tổng hợp các chất này.

NUÔI CẤY MÔ PHÂN SINH

Mô phân sinh thường là các mô đỉnh chồi và cành có kích thước 0,1mm÷ 1cm. Các mô phân sinh dùng để nuôi cấy thường tách từ các mầm non, các chồi mới hình thành hoặc các cành non. Đối với nuôi cấy mô phân sinh sự cân bằng giữa các chất điều hoà sinh trưởng rất quan trọng. Muốn kích thích tạo chồi cần bổ sung cytokinine hoặc tổ hợp cytokinine với auxin. Muốn tạo rễ thì bổ sung các auxin như NAA, IAA,…

Nuôi cấy mô phân sinh được sử dụng để loại virus tạo cây sạch virus và nhân giống in vitro. Nuôi cấy mô phân sinh còn được sử dụng để nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan, tạo cây đa bội qua xử lý colchicin.

Nuôi cấy mô bằng bao phấn NUÔI CẤY BAO PHẤN

Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn đã phát triển và hoàn thiện nhờ công trình nghiên cứu của Bourgin và Nitsch [1967] trên cây thuốc lá, Niizeki và Oono [1968] trên lúa.Từ cuối những năm 1970 đã nhận được cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn trên 30 loại cây. Kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy hạt phấn nuôi cấy có thể phát triển thành cây đơn bội hoàn chỉnh trong điều kiện nuôi cấy in vitro bằng con đường tạo phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua tạo mô sẹo và tạo cơ quan.

NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐƠN

Ngoài khả năng nuôi cấy các cơ quan và mô thực vật, tế bào thực vật có thể được tách và nuôi riêng rẽ trong môi trường phù hợp. Những công trình về nuôi cấy tế bào đơn được tiến hành từ những năm 50 của thế kỷ XX. Tế bào đơn có thể nhận được bằng con đường nghiền mô, hoặc xử lý enzym. Mỗi lọai cây, mỗi loại tế bào khác nhau đòi hỏi những kỹ thuật nuôi cấy khác nhau. Nuôi cấy tế bào đơn được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc tế bào, nghiên cứu ảnh hưởng của các điều kiện khác nhau lên các quá trình sinh trưởng, phát triển và phân hoá của tế bào. Nuôi cấy tế bào đơn còn được sử dụng trong chọn dòng tế bào.

NUÔI CẤY PROTOPLAST

Nuôi cấy protoplats được phát triển nhờ công trình của Cocking [1960]. Ông là người đầu tiên dùng enzym để thuỷ phân thành tế bào và tách được protoplast từ tế bào rễ cà chua. Trong điều kiện nuôi cấy phù hợp protoplast có thể tái sinh thành tế bào mới, phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Do không có thành tế bào nên protoplast trở nên một đối tượng lý tưởng trong nghiên cứu biến đổi di truyền ở thực vật. Bằng phương pháp dung hợp hai protoplast có thể tạo ra các cây lai soma. Ngoài ra còn có thể sử dụng kỹ thuật dung hợp protoplast để chuyển các bào quan và chuyển gene.

BioMedia

1. Nuôi cấy mô tế bào thực vật là gì?

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là tổng hợp những kỹ thuật được sử dụng để duy trì và nuôi cấy các tế bào, mô hoặc cơ quan thực vật trong điều kiện vô trùng trên môi trường nuôi cấy giàu dinh dưỡng với những thành phần đã xác định.

Các kỹ thuật khác nhau trong nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể cung cấp những lợi thế nhất định so với phương pháp nhân giống truyền thống, bao gồm:  

• Tạo ra chính xác số cây nhân bản giúp tạo ra các loại hoa, quả chất lượng cao hoặc có những tính trạng mong muốn khác.
• Tạo ra các cây trưởng thành một cách nhanh chóng
• Tạo ra hàng loạt các cây mà không cần đến hạt hoặc quá trình thụ phấn để tạo hạt.
• Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các tế bào thực vật đã được biến đổi gen.
• Tạo ra các cây trong điều kiện vô trùng, để có thể vận chuyển mà hạn chế tối đa khả năng phát tán bệnh, sâu bệnh hoặc các nhân tố gây bệnh.
• Có thể tạo ra các cây từ hạt mà nếu không có nuôi cấy mô thì thường có tỷ lệ nảy mầm thấp hoặc sinh trưởng yếu, ví dụ: hoa lan hoặc cây nắp ấm.
• Làm sạch các cây bị nhiễm virus nhất định hoặc các nhân tố lây nhiễm khác và nhân nhanh các cây này như là nguồn nguyên liệu sạch phục vụ đồng ruộng và nông nghiệp.

Nuôi cấy mô tế bào thực vật dựa trên thực tế là rất nhiều các tế bào thực vật có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh [còn gọi là totipotency – khả năng biệt hóa của tế bào đơn lẻ thành những tế bào chuyên biệt với số lượng không giới hạn]. Các tế bào đơn lẻ, các tế bào thực vật không có thành tế bào [protoplast], các mảnh lá, rễ hoặc thân, thường có thể được sử dụng để tạo ra các tế bào mới trên môi trường nuôi cấy bổ sung các chất dinh dưỡng và hormone thực vật.

Nguồn ảnh: //biotechnotes.org

 2. Kỹ thuật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật hiện đại được thực hiện trong điều kiện vô trùng, không khí lọc qua HEPA, được thực hiện trong tủ cấy. Các nguồn nguyên liệu: Thực vật sống lấy từ môi trường thường bị lây nhiễm bởi các vi sinh vật, vì vậy, khâu khử trùng bề mặt của nguyên liệu ban đầu [mẫu cấy] trong dung dịch hóa chất [thường sử dụng cồn và natri hoặc canxi hypochlorite] là cần thiết. Các mẫu cấy sau đó thường được đặt trên bề mặt của môi trường nuôi cấy đặc, nhưng đôi khi cũng được đặt trực tiếp vào trong môi trường lỏng, đặc biệt là khi sử dụng dịch nuôi cấy tế bào ở giai đoạn nghỉ. Môi trường nuôi cấy lỏng và đặc thường chứa các muối vô cơ và một ít chất dinh dưỡng hữu cơ, vitamin và các hormone thực vật. Môi trường đặc được pha từ môi trường lỏng bằng cách thêm các chất tạo gel.

 Các thành phần của môi trường, đặc biệt là các hormone thực vật và nguồn Nitơ [các loại muối nitrat, ammonium hoặc amino acid] có ảnh hưởng sâu sắc đến hình thái của các mô sinh trưởng từ nguồn mẫu ban đầu. Ví dụ, sự tăng cường auxin sẽ kích thích sự phát triển rễ, trong khi sự tăng cường của cytokinin kích thích sự phát triển chồi. Sự cân bằng của cả auxin và cytokinin sẽ tạo ra mô sẹo [callus], nhưng hình thái của sản phẩm sẽ phụ thuộc vào từng loài thực vật cũng như là thành phần môi trường.

Khi các mẫu nuôi cấy sinh trưởng, các mảnh tế bào thường được cắt và chuyển sang môi trường mới [subcultured] để có thể sinh trưởng hoặc thay đổi về hình thái của mẫu. Thao tác và kinh nghiệm của người làm nuôi cấy mô là rất quan trọng trong việc quyết định mẫu nào được nuôi cấy và mẫu nào cần loại bỏ. Các chồi nảy sinh từ một mẫu nuôi cấy, sau đó có thể được cắt ra, tạo rễ bằng auxin và tạo cây con, khi trưởng thành, có thể được chuyển vào trong chậu đất hoặc xa hơn, có thể sinh trưởng trong điều kiện nhà kính như là cây tự nhiên.

Mô tế bào thu từ một cây mà sẽ được nuôi cấy thì được gọi là mẫu cấy. Dựa trên từng loại cây nhất định, đặc biệt là cây thuốc lá, mà mẫu cấy thường có thể lấy từ tất cả các phần của cây, bao gồm các phần của chồi, lá, thân, hoa, rễ và các tế bào đơn lẻ hoặc các tế bào chưa biệt hóa. Tuy nhiên, điều này không đúng với tất cả mọi loài thực vật. Ở rất nhiều loài, mẫu cấy của các cơ quan khác nhau có tỷ lệ sinh trưởng và tái sinh khác nhau, trong khi có những mẫu hoàn toàn không hề sinh trưởng. Việc lựa chọn nguồn mẫu nhập cũng xác định dựa trên cây con tạo ra từ nuôi cấy mô là cây đơn bội hay nhị bội. Thêm vào đó, nguy cơ lây nhiễm với vi sinh vật cũng bị tăng lên nếu lựa chọn mẫu cấy không thích hợp.

Một vài mẫu cấy, như chóp rễ, thường khó để phân lập và dễ bị nhiễm các vi sinh vật đất, gây trở ngại trong quá trình nuôi cấy mô. Các vi sinh vật đất nhất định có thể tạo thành liên kết chặt chẽ với hệ rễ, hoặc thậm chí sinh trưởng ngay bên trong rễ. Các hạt đất bám vào rễ thường khó loại bỏ để không gây tổn thương đến rễ, dễ tạo điều kiện cho vi sinh vật tấn công. Các vi sinh vật liên kết này sẽ thường sẽ sinh trưởng rất nhanh trên môi trường nuôi cấy, trước khi có sự sinh trưởng đáng kể của mô thực vật.

Một vài mô nuôi cấy sinh trưởng chậm chạp. Đối với trường hợp đó, có thể có 2 lựa chọn: [i] tối ưu hóa môi trường nuôi cấy; [ii] nuôi cấy các mô hoặc loài có khả năng đáp ứng cao. Quá trình hoại tử có thể làm hỏng các mô nuôi cấy. Thông thường, các loài thực vật khác nhau thì khác nhau về tính nhạy cảm đối với quá trình hoại tử của các mô. Vì vậy, bằng việc nuôi cấy các giống [hoặc mô] có khả năng đáp ứng cao, điều đó có thể được giải quyết.

Các cơ quan ở bên trên mặt đất [thân, lá, chồi, hoa…] cũng thường chứa nhiều vi sinh vật không mong muốn. Tuy nhiên, chúng thường dễ dàng loại bỏ được bằng cách rửa nhẹ và phần còn sót lại có thể diệt bằng cách khử trùng bề mặt. Hầu hết các chủng vi sinh vật bề mặt không hình thành liên kết chặt chẽ với các mô thực vật. Những liên kết đó có thể được nhận ra bằng cách kiểm tra trực quan như là thể khảm, chuyển màu hoặc hoại tử cục bộ trên bề mặt mẫu cấy.

Một cách khác để thu mẫu cấy không bị nhiễm là lấy mẫu từ cây con sinh trưởng ra từ hạt đã khử trùng bề mặt. Bề mặt cứng của hạt làm các tác nhân khử trùng bề mặt khó thấm qua, ví dụ như hypoclorite, vì thế các điều kiện hợp lý để khử trùng hạt có thể nghiêm ngặt hơn nhiều so với khử trùng các mô thực vật.

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là nuôi cấy các dòng [clones]. Nếu như cây gốc được sử dụng để tạo ra các mẫu cấy đầu tiên có tính nhạy cảm với các tác nhân hoặc điều kiện môi trường, thì toàn bộ sản phẩm sẽ bị nhạy cảm với các vấn đề tương tự. Ngược lại, các tính trạng tốt cũng sẽ duy trì theo từng dòng.

 3. Ứng dụng

Nuôi cấy mô tế bào thực vật được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu thực vật, lâm nghiệp, và đồng ruộng. Các ứng dụng bao gồm:

• Thương mại hóa sản xuất các loài thực vật sử dụng như là cây cảnh, trang trí phong cảnh và các lĩnh vực liên quan đến hoa, là thứ mà sử dụng nuôi cấy mô phân sinh và chồi để tạo ra số lượng lớn các cá thể giống hệt nhau.
• Bảo tồn các giống cây hiếm hoặc đang bị đe dọa.
• Các nhà nhân giống có thể ưu tiên sử dụng nuôi cây mô để sàng lọc các tế bào hơn là sàng lọc cây trồng để tìm các tính trạng tốt, ví dụ kháng/chống chịu thuốc diệt cỏ.
• Sinh trưởng quy mô lớn các tế bào thực vật trong môi trường lỏng trong các bioreactors để tạo ra các hợp chất có giá trị, giống như sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật và protein tái tổ hợp, được sử dụng như là dược phẩm sinh học.
• Lai xa các loài thực vật bằng cách bởi dung hợp protoplast và tái sinh các phép lai mới.
• Nghiên cứu nhanh cơ sở phân tử của các cơ chế sinh lý, sinh hóa và sinh sản ở thực vật, ví dụ như chọn lọc in vitro các cây chống chịu với các điều kiện bất lợi và các nghiên cứu quá trình ra hoa in vitro.
• Lai-thụ phấn các loài xa nhau và sau đó nuôi cấy tế bào hợp tử được tạo thành [thường dễ bị chết nếu diễn ra trong tự nhiên] [cứu phôi].
• Các thể đột biến nhân đôi nhiễm sắc thể và sự hình thành của các thể đa bội, ví dụ nhân đôi đơn bội, tứ bội và các dạng khác của thể đa bội có được tạo ra bằng cách áp dụng các chất chống phân bào [antimitotic] như là colchicine hoặc oryzalin.
• Các mô tế bào nuôi cấy sau khi biến nạp có thể sử dụng để thử nghiệm ngắn hạn các cấu trúc di truyền [genetic constructs] hoặc tái sinh tạo các cây chuyển gen.
• Các kỹ thuật nhất định như là nuôi cấy đỉnh phân sinh có thể được sử dụng để tạo nguồn nguyên liệu thực vật sạch từ nguồn bị lây nhiễm virus như là khoai tây và rất nhiều các loài có quả mềm.
• Có thể tạo ra các loài lai vô trùng giống hệt nhau.

Dịch và tổng hợp từ Wikipedia

BioMedia VN