Chuyển gen bằng phương pháp plasmid
Vào năm 1974, lần đầu tiên các nhà khoa học phát hiện thấy rằng, sau khi tiêm DNA của retrovirus SV40 vào khoang phôi (blastocoel) của túi phôi chuột, DNA này có thể được tìm thấy sau đó trong các tế bào của chuột trưởng thành (Jaenisch,1974; Jaenisch và Mintz,1974). DNA provirus Mo-Mulv sử dụng trong các thí nghiệm như thế này đã tích hợp vào genome và truyền lại cho thế hệ sau, do đó đã tạo nên các dòng chuột ổn định (Stuhlmann, Jahner và Jaenisch,1981). Từ đó, việc sử dụng virus làm vector cho các DNA ngoại lai đã được phát triển. Phương pháp này tuy thao tác hơi phức tạp nhưng có ưu điểm là hiệu quả chuyển gen cao. Hơn nữa gen cấu trúc gắn vào vector virus sẽ sử dụng promoter của virus, các promoter này thường có hoạt tính cao do đó gen cấu trúc này sẽ được biểu hiện mạnh trong tế bào chủ. Về nguyên tắc, bất kỳ loại virus nào cũng có thể được sử dụng làm vector để chuyển vật liệu di truyền vào trong tế bào. Nhiều nhóm trong số đó, các papovavirus, adenovirus, retrovirus...được sử dụng vào những mục đích chuyên biệt. Ðể sử dụng làm vector, các phần khác nhau của genome virus được thay thế bằng gen cấu trúc quan tâm. Virus có thể được sử dụng để lây nhiễm vào tế bào giai đoạn sớm của phôi trước khi được chuyển ghép vào con mẹ. Gen chuyển với vector retrovirus xâm nhập một cách hiệu quả vào hệ gen của vật chủ nhưng virus sử dụng phải là virus an toàn, không gây bệnh. Các cơ thể chuyển gen sinh ra từ phương pháp này là ở dạng khảm, có nghĩa là không phải tất cả các tế bào của cơ thể đều mang retrovirus. Gen chuyển chỉ có thể di truyền được nếu retrovirus hợp nhất vào một số tế bào sinh dục. Ðối với phương pháp này tỉ lệ sống của các động vật chuyển gen sơ sinh là rất thấp. Nếu như các thao tác di truyền là chuẩn xác, không gây ra sự sẩy thai, thì thế hệ động vật đầu tiên (F1) cần kiểm tra sự biểu hiện của gen chuyển. Khi gen chuyển đã hợp nhất trong các tế bào sinh dục thì được gọi là thể khảm dòng mầm và sau đó chúng được lai cùng dòng khoảng 10-20 thế hệ cho đến khi thu được các động vật chuyển gen đồng hợp tử và gen chuyển có mặt ở trong tất cả mọi tế bào. Ở giai đoạn này, phôi mang gen chuyển có thể được đông lạnh và được bảo quản cho các quá trình cấy chuyển về sau.
Xuất phát từ lý do các tế bào gốc phôi (tế bào phôi ở giai đoạn 16-32 tế bào) là các tế bào đa năng (totipotent) nghĩa là có thể phân hoá thành bất kỳ loại mô nào và từ đó sẽ tạo nên cơ thể hoàn chỉnh. Từ các túi phôi nuôi cấy in vitro, người ta đã tiến hành tách chiết các tế bào gốc phôi và biến nạp gen ngoại lai vào những tế bào này. Sau khi chọn ra những tế bào đã được biến nạp gen lạ người ta đưa nó vào phôi khác ở giai đoạn phôi nang để tạo ra động vật chuyển gen thể khảm. Trên 30% động vật chuyển gen tạo thành là những động vật chuyển gen thể khảm dòng mầm mang kiểu gen của dòng tế bào này. Ở đây các tế bào gốc phôi được sử dụng như là một phương tiện để chuyển gen (Mintz, 1977). Ưu điểm của phương pháp chuyển gen này là tỉ lệ phôi sống sót sau thao tác, sự tích hợp và biểu hiện tính trạng của gen mới khá cao. Ðiều quan trọng hơn là trong thực tế việc chuyển gen có thể được tiến hành thông qua sự thao tác với phôi dâu và túi phôi. Phôi ở các giai đoạn này có thể thu nhận mà không cần phẫu thuật (đặc biệt là đối với bò), do vậy công việc chuyển gen được tiến hành rất dễ dàng. Phương pháp này có ý nghĩa đặc biệt đối với sự nghiên cứu kiểm tra di truyền của các quá trình phát triển. Sự thuận lợi của nó là cho phép tạo ra một cách chính xác các đột biến gen xác định bằng tái tổ hợp đồng dạng. Trong tương lai phương pháp sử dụng tế bào gốc phôi sẽ được sử dụng rộng rãi để tạo động vật chuyển gen. Có ba cách tạo động vật chuyển gen từ các tế bào gốc phôi mang gen chuyển: -Thứ nhất, phương pháp được dùng trước mắt là bơm một số tế bào gốc phôi (khoảng 5-10 tế bào) vào trong xoang phôi nang của tế bào động vật. -Thứ hai, xen một số tế bào gốc phôi vào giữa bào thai thời kỳ 8 tế bào. -Thứ ba, nuôi cấy chung tế bào gốc phôi với phôi qua đêm.
Ðể DNA dễ xâm nhập được vào tế bào thực vật, phải loại bỏ vách tế bào tạo protoplast. Protoplast có thể được duy trì trong môi trường nuôi cấy như các tế bào sinh trưởng một cách độc lập hoặc với một môi trường đặc hiệu, vách tế bào có thể được tạo thành và toàn bộ các cây có thể được tái sinh từ các tế bào này. Quá trình chuyển gen như thế này được thực hiện một cách trực tiếp bằng một cơ chế vật lý đơn giản, không cần có vector. Ðể nâng cao hiệu quả biến nạp, người ta đã đã xử lý protoplast với PGE (polyethylene glycol) hoặc bằng xung điện. Phương pháp chuyển gen này rất có hiệu quả, đặc biệt đối với những loài thực vật mà phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium không thể thực hiện được. Tuy nhiên, việc tạo protoplast cũng như tái sinh cây từ protoplast không đơn giản, tốn nhiều công sức, bị ảnh hưởng của nhiều yếu tố môi trường. Với phương pháp này, các nhà khoa học đã chuyển gen thành công vào một số loài cây một lá mầm như loài lúa phụ Japonica (Datta, 1990), ngô (Doon, 1990), lúa mì (Vassil, 1992). Kỹ thuật xung điện (electroporation) là một phương pháp cơ học được sử dụng để đưa các phân tử phân cực vào trong tế bào chủ qua màng tế bào. Trong phương pháp này, một xung điện cao thế trong khoảnh khắc (vài phần nghìn giây) có khả năng làm rối loạn cấu trúc màng kép phospholipid, tạo ra các lỗ thủng tạm thời cho phép các phân tử DNA ngoại lai từ môi trường xâm nhập vào bên trong tế bào. Nhiều kỹ thuật nghiên cứu trong sinh học phân tử yêu cầu đưa gen hoặc protein ngoại lai vào trong tế bào chủ. Vì lớp phospholipid kép của màng sinh chất có một đầu ưa nước phía ngoài và một đầu ưa nước phía trong , nên bất kỳ phân tử phân cực nào, bao gồm cả DNA và protein, đều không có khả năng đi qua màng một cách tự do (Farabee, 2001).
Súng bắn gen (Gene gun) là một thiết bị sử dụng để đưa thông tin di truyền vào tế bào, được thiết kế đầu tiên cho biến nạp DNA ngoại lai vào tế bào thực vật và được phát triển vào đầu thập niên 1980 do các nhà thực vật học ở Ðại học Corrnell cùng với các nhà nghiên cứu ở Corrnell Nanofabrication Facility, Newyork, USA. Súng bắn gen được bán trên thị trường vào năm 1990. Ðạn sử dụng cho loại súng này là các hạt kim loại nặng cơ bản được bao bọc DNA. Tên chính xác và đầy đủ của súng bắn gen là hệ thống phân phối hạt biolistics (biolistic particle delivery system) và kỹ thuật này thường được gọi một cách đơn giản là biolistics (sự kết hợp giữa hai thuật ngữ biology (sinh học) và ballistics (sự bắn tung)). Mặc dù có nhiều thiết kế kỹ thuật khác nhau nhưng nguyên lý chung của phương pháp này là sử dụng áp lực xung của khí helium để gai tốc các hạt.
Tinh trùng trưởng thành có genome bất hoạt không có khả năng tái bản. DNA của nó được bao phủ bởi protamine làm cho DNA ngoại lai rất khó đi vào trong genome tinh trùng. Vì vậy DNA ngoại lai không có cơ hội để hợp nhất vào DNA tinh trùng. Các thí nghiệm thực hiện cách đây khoảng gần một thập kỷ cho thấy rằng tinh trùng ủ với DNA có thể mang DNA đến trứng trong quá trình thụ tinh dẫn đến kết quả là tạo ra chuột chuyển gen. Các nghiên cứu hóa sinh học cho thấy DNA bám vào tinh trùng một cách dễ dàng nhưng không chứng minh được rằng điều này xảy ra do sự xâm nhập của DNA. Vì thế tinh trùng đóng vai trò là một thể truyền đối với DNA ngoại lai. Sau một vài năm, phương pháp này được áp dụng rộng rãi với bò, lợn, cừu và cá medaka (Hình 2.24). Trong tất cả các trường hợp này không hiểu tại sao các thí nghiệm rất khó thành công. Hơn nữa, phần lớn các trường hợp, DNA ngoại lai hợp nhất vào genome vật chủ đã được sắp xếp lại ở mức độ cao. Một nghiên cứu đã cho thấy rằng ngay cả sau khi đã rửa cẩn thận, tinh trùng chứa DNAse đã phân hủy DNA ngoại lai. DNAse có rất nhiều trong nguyên sinh chất của tinh trùng và lượng enzyme này bám vào tinh trùng là thay đổi đã giải thích tại sao thí nghiệm này không thành công và tại sao DNA ngoại lai bị phân cắt. DNA ngoại sinh dường như gây ra hoạt tính DNAse ở tinh trùng đã tách chiết ra. Có thể giải thích hiện tượng này là DNAse một phương tiện để bảo vệ tinh trùng tránh khỏi sự nhiễm DNA ngoại sinh trên đường từ mào tinh hoàn đến tế bào trứng (Baccetti và Spadafora, 2000). Các thử nghiệm để tăng DNA xâm nhập vào tinh trùng đã được thực hiện. Sự xung điện hoặc chuyển nhiễm với các tác nhân hóa học đã làm tăng sự hấp thu DNA vào tinh trùng. Hiện tượng này thường được kèm theo do khả năng thụ tinh cho bào trứng của tinh trùng. Ở Xenopus, chuyển gen vào phôi bằng vi tiêm dẫn đến sự biểu hiện của gen ngoại lai và nó tồn tại từ vài ngày đến vài tuần nhưng lại không hợp nhất vào genome vật chủ. Ðể khắc phục khó .
Chuyển gen vào tiền thể tinh trùng in vitro Tinh trùng thành thục được tạo ra từ các tế bào gốc thông qua các giai đoạn khác nhau của sự biệt hóa (Hình 2.25). Các tế bào gốc tinh trùng có thể được tách chiết, nuôi cấy in vitro trong một thời gian ngắn và được cấy chuyển vào tinh hoàn nhận. Các tế bào cấy chuyển này hoạt động theo chương trình biệt hóa của chúng làm cho tinh trùng hoạt động chức năng. Tỉ lệ tinh trùng tạo thành từ các tế bào gốc cấy chuyển được tăng lên nhiều nhờ sự xử lý các con đực nhận với bisulfan. Bisulfan là một loại thuốc ngăn cản sự biệt hóa của tế bào gốc tinh hoàn. Protocol này đã được sử dụng một cách thành công để chuyển gen vào tế bào gốc trong quá trình nuôi cấy. Ðiều này đạt được nhờ sử dụng vector retrovirus hiệu quả. Các tế bào gốc cấy chuyển vào con đực nhận đã xử lý bisulfan dẫn đến kết .
Các bước khác nhau của sự biệt hóa tế bào gốc thành tinh trùng Các tế bào gốc hoặc các tế bào đã biệt hóa một cách cục bộ được tách chiết, nuôi cấy và chuyển DNA chọn lọc vào. Tinh trùng mang DNA ngoại lai này được sử dụng để thụ tinh bằng phương pháp ICSC Tế bào gốc được tách chiết, nuôi cấy dưới những điều kiện ngăn cản sự biệt hóa của chúng, được chuyển DNA ngoại lai vào, được chọn lọc và đưa vào lại một tinh hoàn nhận, nơi mà chúng biệt hóa. Tinh trùng tạo ra được sử dụng để thụ tinh trứng bằng phương pháp thông thường quả là tạo ra chuột chuyển gen với tỉ lệ cao, khoảng 4%(Nagano, 2001). Phương pháp này là hữu dụng để nghiên cứu ảnh hưởng sinh học của gen trong quá trình thành thục tế bào gốc tinh trùng và để tạo động vật chuyển gen. Có thể suy ra phương pháp này ít thành công hơn đối với các loài lớn hơn chuột. Dường như cần thiết phải sử dụng các tế bào đã được biến nạp cao hơn để tăng cơ hội định cư ở tinh hoàn với một tỉ lệ chấp nhận được. DNA liên kết với thể chuyển nhiễm có thể được tiêm vào các ống sinh tinh (Hình dưới). Một số nhóm nghiên cứu đã thành công trong việc tạo chuột chuyển gen bằng cách sử dụng tinh trùng của các động vật đã được xử lý (Sato, 2002). Những kết quả khích lệ này có hiệu quả vừa phải và hãy còn chưa đạt chuẩn. Hiện chúng đang được cải tiến nhưng chắc chắn là chưa có cách nào làm cho có thể áp dụng rộng rãi phương pháp này đối với các động vật lớn hơn chuột. Quả thực cấu trúc của các ống dẫn tinh khác nhau và việc tiêm DNA là khó. Mặt khác, lượng DNA tiêm vào có thể là rất lớn và khó điều khiển.
Kỹ thuật viêm gen một phương pháp điều trị bệnh bằng liệu pháp gen thông qua đường uống thuốc. Một lượng DNA liệu pháp (dạng plasmid hay phức hợp DNA-peptid) được bọc bởi một màng lipid hỗn hợp đặc hiệu như màng bọc các viên thuốc thông thường tạo ra viên gen. Viên gen được đưa vào cơ thể theo đường miệng bằng cách uống. Sau khi được được phóng thích, gen liệu pháp được hấp thụ qua màng đi vào tế bào biểu mô ruột. Ở đây gen liệu pháp được phiên mã và dịch mã thành protein dược phẩm. Protein dược phẩm tiết vào máu, đến các mô bệnh để ức chế sự hoạt động của các gen bệnh . Kỹ thuật viên gen là một phương pháp mới (được cấp bằng phát minh vào ngày 3/5/2001) lần đầu tiên được sử dụng để chữa bệnh tiểu đường bằng cách sử dụng một viên gen được tạo thành từ DNA mã hóa inssulin. Phương pháp này đã khắc phục được các hạn chế của các phương pháp truyền thống như vấn đề liều lượng và phân phối thuốc. Nó có thể cách mạng hóa liệu pháp gen và cho các bệnh nhân một sự chọn lựa để đưa insulin vào cơ thể hàng ngày. Tuy nhiên, tính có ích của viên gen sẽ phụ thuộc vào sự biểu hiện và phân phối của gen trong các tế bào ruột non và hãy còn chưa chắc chắn là có thích hợp đối với các protein cần thiết với liều lượng khớp một cách tinh vi không.
https://voer.edu.vn/m/cac-phuong-phap-chuyen-gen/993889db Page 2
Như chúng ta đã biết ba quá trình thiết yếu cho sự tồn tại của tế bào, đó là: tái bản, phiên mã và dịch mã. Tuy nhiên, tế bào không t... |