Kỹ thuật Northern blot nghiên cứu sự biểu hiện của

Thấm northern cho phép quan sát biểu hiện của gen ở các mô, cơ quan, giai đoạn phát triển, các độ stress môi trường, nhiễm mầm bệnh và trong quá trình điều trị.[9][15][17] Các kĩ thuật này đã được sử dụng để chỉ ra sự biểu hiện quá mức của gen sinh ung (gen ung thư) và giảm biểu hiện của gen ức chế khối u trong các tế bào ung thư so với tế bào bình thường;[11] cũng như sự biểu hiện gen trong quá trình thải trừ tạng ghép.[18] Nếu phát hiện một gen tăng biểu hiện (khi thấy nhiều mRNA trong northern blot), mẫu thử có thể được đem đi xác định trình tự để biết đó là gen đã biết hay gen mới.[18] Nghiên cứu các qui luật biểu hiện gen trong các điều kiện khác nhau có thể cho ta cái nhìn rõ hơn về chức năng của gen đó. Vì RNA được phân tán theo kích thước, nếu chỉ có một kiểu đoạn dò được sử dụng thì sự đa dạng trong cấp độ của mỗi băng trên màng cho ta biết về kích thước của sản phẩm, gợi ý rằng đó có thể là vì sự cắt thay thế hoặc do đoạn mô tip lặp lại.[8][14] Sự đa dạng trong kích thước của một sản phẩm di truyền cũng có thể biểu thị các lỗi sai hay sự xoá trong quá trình phiên mã. Thay đổi mục tiêu của đoạn dò theo những đoạn mạch đã biết sẽ giúp xác định đoan RNA nào đã biến mất.[2]

Phân tích biểu hiện gen có thể được thực hiện bằng một số phương pháp khác nhau bao gồm RT-PCR, RNase protection assays, microarrays (vi dãy hoặc vi mảng), RNA-Seq, phân tích hàng loại biểu hiện gen (SAGE), cũng như thấm northern.[4][5] Microarrays thường được dùng và thường cho kết quả giống với thấm northern; tuy nhiên, thấm northern đôi khi có thể phát hiện những tha. y đổi nhỏ trong biểu hiện gen mà microarrays không làm được.[19] Ưu điểm của microarrays so với thấm northern là nó có thể kiểm tra hàng nghìn gen cũng lúc, trong khi thấm northern chỉ có thể làm được một hoặc một số ít gen.[17][19]

Một vấn đề của thấm northern là mẫu thử thường bị các ezyme RNase làm xuống cấp (cả ezyme nội sinh lẫn trong môi trường). Có thể hạn chế vấn đề này bằng cách khử trùng vật dụng thí nghiệm và dùng chất ức chế RNase như DEPC (diethylpyrocarbonate).[5] Hóa chất được sử dụng trong thấm northern có thể gây nguy hiểm cho người thực hiện, vì formaldehyde, chất phóng xạ, ethydium bromide, DEPC và UV đều gây hại khi tiếp xúc nhiều.[11] So với RT-PCR, thấm northern có độ nhạy thấp, nhưng lại có độ đặc hiệu cao - một yếu tố quan trọng để giảm thiểu kết quả dương tính giả.[11]

Ưu điểm của thấm northern bao gồm xác định kích thước RNA, quan sát được các sản phẩm của cách cắt thay thế, có thể sự dụng đoạn dò có độ tương thích không hoàn toàn, chất lượng và số lượng của RNA có thể đựoc đo trong gel trước khi tiến hành thấm, và màng thấm có thể được lưu trữ và dò lại rất nhiều năm sau khi thấm.[11]

Trong thí nghiệm thấm northern để dò mRNA của acetylcholinesterase, kĩ thuật không dùng chất phóng xạ đã được nhận thấy là có hiệu quả bằng với dùng chất phóng xạ, nhưng lại tiết kiệm thời gian và không cần dùng đồ bảo vệ khỏi phóng xạ.[20]

Các nhà nghiên cứu thỉnh thoảng sẽ dùng một biến thể của phương pháp này: thấm northern ngược. Trong phương pháp thấm northern ngược, chất acid nucleic (đã được cố định vào màng) là một bộ những đoạn DNA đã được cô lập, và đoạn dò sẽ là RNA chiết xuất từ mô được đánh dấu phóng xạ. Kĩ thuật DNA microarray phổ biến vào cuối những năm 1990 và đầu những năm 2000s giống với phương pháp này hơn, cũng sữ dụng DNA dán sẵn vào cơ chất, rồi đem lai với đoạn dò RNA của tế bào. Cho nên phương pháp thấm northern ngược, dù trước đó không phổ biến, đã cho phép phân tích northern tiến hóa lên thành "lập hồ sơ biểu hiện gen". Trong đó, biểu hiện của nhiều (có thể là tất cả) gen của một sinh vật đã được theo dõi.

• Phương pháp thấm western
• Phương pháp thấm eastern
• Phương pháp thấm northwestern
• Phương pháp thấm far-eastern
• Phương pháp thấm far-western
• DDRT-PCR

1. ^ Gilbert, S. F. (2000) Developmental Biology, 6th Ed. Sunderland MA, Sinauer Associates.
2. ^ a b c Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J. Raff, M., Roberts, K., Walter, P. 2008. Molecular Biology of the Cell, 5th ed. Garland Science, Taylor & Francis Group, NY, pp 538–539.
3. ^ Kevil, C. G., Walsh, L., Laroux, F. S., Kalogeris, T., Grisham, M. B., Alexander, J. S. (1997) An Improved, Rapid Northern Protocol. Biochem. and Biophys. Research Comm. 238:277–279.
4. ^ a b Schlamp, K.; Weinmann, A.; Krupp, M.; Maass, T.; Galle, P. R.; Teufel, A. (2008). “BlotBase: A northern blot database”. Gene. 427 (1–2): 47–50. doi:10.1016/j.gene.2008.08.026. PMID18838116.
5. ^ a b c d e Trayhurn, P. (1996) Northern Blotting. Pro. Nutrition Soc. 55:583–589.
6. ^ Trayhurn, P. (1996) Northern Blotting. Pro. Nutrition Soc. 55:583–589.
7. ^ Trayhurn, P. (1996) Northern Blotting. Pro. Nutrition Soc. 55:583–589.
8. ^ a b Trayhurn, P. (1996) Northern Blotting. Pro. Nutrition Soc. 55:583–589.
9. ^ a b Mori, H.; Takeda-Yoshikawa, Y.; Hara-Nishimura, I.; Nishimura, M. (1991). “Pumpkin malate synthase Cloning and sequencing of the cDNA and Northern blot analysis”. Eur. J. Biochem. 197 (2): 331–336. doi:10.1111/j.1432-1033.1991.tb15915.x. PMID1709098.
10. ^ a b Yang, H.; McLeese, J.; Weisbart, M.; Dionne, J.-L.; Lemaire, I.; Aubin, R. A. (1993). “Simplified high throughput protocol for Northern hybridization”. Nucleic Acids Research. 21 (14): 3337–3338. doi:10.1093/nar/21.14.3337. PMC309787. PMID8341618.
11. ^ a b c d e f g h i j k l Streit, S.; Michalski, C. W.; Erkan, M.; Kleef, J.; Friess, H. (2009). “Northern blot analysis for detection of RNA in pancreatic cancer cells and tissues”. Nature Protocols. 4 (1): 37–43. doi:10.1038/nprot.2008.216. PMID19131955. S2CID24980302.
12. ^ Yamanaka, S.; Poksay, K. S.; Arnold, K. S.; Innerarity, T. L. (1997). “A novel translational repressor mRNA is edited extensively in livers containing tumors caused by the transgene expression of the apoB mRNA-editing enzyme”. Genes Dev. 11 (3): 321–333. doi:10.1101/gad.11.3.321. PMID9030685.
13. ^ Valoczi, A., Hornyik, C., Varga, N., Burgyan, J., Kauppinen, S., Havelda, Z. (2004) Sensitive and specific detection of microRNAs by northern blot analysis using LNA-modified oligonucleotide probes. Nuc. Acids Research. 32: e175.
14. ^ a b Gortner, G.; Pfenninger, M.; Kahl, G.; Weising, K. (1996). “Northern blot analysis of simple repetitive sequence transcription in plants”. Electrophoresis. 17 (7): 1183–1189. doi:10.1002/elps.1150170702. PMID8855401. S2CID36857667.
15. ^ a b Liang, P. Pardee, A. B. (1995) Recent advances in differential display. Current Opinion Immunol. 7: 274–280.
16. ^ a b Engler-Blum, G.; Meier, M.; Frank, J.; Muller, G. A. (1993). “Reduction of Background Problems in Nonradioactive Northern and Southern Blot Analysis Enables Higher Sensitivity Than 32P-Based Hybridizations”. Anal. Biochem. 210 (2): 235–244. doi:10.1006/abio.1993.1189. PMID7685563.
17. ^ a b Baldwin, D., Crane, V., Rice, D. (1999) A comparison of gel-based, nylon filter and microarray techniques to detect differential RNA expression in plants. Current Opinion in Plant Biol. 2: 96–103.
18. ^ a b Utans, U.; Liang, P.; Wyner, L. R.; Karnovsky, M. J.; Russel, M. E. (1994). “Chronic cardiac rejection: Identification of five upregulated genes in transplanted hearts by differential mRNA display”. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91 (14): 6463–6467. doi:10.1073/pnas.91.14.6463. PMC44222. PMID8022806.
19. ^ a b Taniguchi, M.; Miura, K.; Iwao, H.; Yamanaka, S. (2001). “Quantitative Assessment of DNA Microarrays – Comparison with Northern Blot Analysis”. Genomics. 71 (1): 34–39. doi:10.1006/geno.2000.6427. PMID11161795.
20. ^ Kreft, K., Kreft, S., Komel, R., Grubič, Z. (2000). Nonradioactive northern blotting for the determination of acetylcholinesterase mRNA. Pflügers Arch – Eur J Physiol, 439:R66-R67

• OpenWetWare

Bản mẫu:Molecular probes